作者：胡利琳 杨玲
全球消化系统疾病领域最高学术水平会议美国消化疾病周（DDW2024）于日前落下帷幕，但精彩仍在继续。华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科杨玲教授团队在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）炎症及肝纤维化机制上的研究取得突破，在大会上作电子壁报交流。研究题目：“肝细胞特异性敲除TRIF通过激活肝细胞坏死性凋亡加重NASH小鼠肝脏炎症及纤维化”（编号：EP82），主要内容整理如下。
研究背景及目的：
非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球慢性肝病的主要病因，可发展为非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌。肝细胞死亡是引发NASH和随后肝纤维化的关键事件，因此抑制肝细胞死亡是治疗NASH的重要策略。
含TIR结构域的衔接子诱导IFN-β（TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β，TRIF）是TLR4信号下游的重要衔接蛋白，在NASH中起关键作用。最近研究发现，抑制肝细胞坏死性凋亡可改善NASH小鼠肝脏炎症。然而在NASH疾病状态下，TRIF分子如何调控肝细胞发生坏死性凋亡尚不清楚，因此本研究目的为探讨肝细胞TRIF分子在NASH肝脏坏死性凋亡中的作用。
研究方法：
（1）采用CRISPR/Cas9技术构建出TRIFflox/flox小鼠，随后利用Cre-Lox系统将TRIFflox/flox小鼠与Alb-cre工具鼠进行杂交，成功繁育出肝细胞特异性敲除TRIF基因小鼠（TRIFΔHEP）及同窝对照小鼠（TRIFflox/flox）。随后连续给予8周龄TRIFflox/flox和TRIFΔHEP小鼠22周高脂饮食（High-fat diet，HFD）或者对照饮食（Chow diet，CD）。通过生化试剂盒检测血清肝酶含量以及肝脏HE、Masson染色、天狼星红染色及实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）评估肝脏炎症及纤维化水平；F4/80免疫组化染色评估肝脏巨噬细胞浸润情况。
（2）分离小鼠原代肝细胞进行RNA-seq测序。qPCR分析小鼠肝脏坏死性凋亡相关分子mRNA表达。Western blot和免疫组化检测肝脏坏死性凋亡关键基因蛋白表达水平。
（3）对部分TRIFflox/flox和TRIFΔHEP小鼠，高脂喂养第13周开始腹腔注射坏死性凋亡抑制剂Nec-1（1.65 mg/kg，间隔1天注射1次）及对照溶剂Veh，直至22周高脂喂养结束。四组小鼠检测指标及检测方法同上。
研究结果：
（1）肝细胞特异性敲除TRIF加重高脂饮食诱导的NASH小鼠肝脏炎症及纤维化水平（图1）。血清ALT和AST水平、肝脏炎性细胞浸润比例和肝组织马松染色阳性面积等指标均升高。
图1
（2）小鼠原代肝细胞RNA-Seq提示肝细胞特异性敲除TRIF所致差异基因富集于炎症信号通路及坏死性凋亡分子（图2）。差异表达基因聚类热图可见肝细胞特异性敲除TRIF组、Ripk3和MIkl等坏死性凋亡关键分子上调。
图2
(3)肝细胞特异性敲除TRIF激活高脂饮食诱导的NASH小鼠肝细胞发生坏死性凋亡(图3)。
图3
（4）坏死性凋亡抑制剂显著缓解肝细胞TRIF敲除对高脂饮食诱导的NASH小鼠肝脏炎症及纤维化的加重作用（图4）。可见小鼠血清ALT和AST下降，肝脏炎症因子、纤维化相关指标mRNA表达减少。
图4
（5）腹腔注射Nec-1逆转肝细胞特异性敲除TRIF对高脂饮食诱导的NASH小鼠肝脏坏死性凋亡的激活（图5）。
图5
结论：
肝细胞特异性敲除TRIF通过激活肝细胞发生坏死性凋亡加重NASH小鼠肝脏炎症和纤维化。肝细胞TRIF分子有希望成为NASH治疗的一个新靶点。
来源：Lilin Hu,Ling Yang*.Hepatocyte-specific TRIF deletion aggravates liver inflammation and fibrosis in NASH by activating hepatocyte necroptosis.Digestive Disease Week 2024.Washington,D.C.USA.2024.5.18-2024.5.21(ePoster)
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